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自然論文:走向更亮更耐光的熒光團

發布時間:2024-08-05

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熒光成像為生命科學研究帶來了無限可能,從寬場熒光到共聚焦,再到超分辨,我們觀察的精度不斷提升,但一個問題始終存在——熒光淬滅。今天我們來看看《自然》雜志的工具論文,“走向更亮更耐光的熒光團”,了解下更耐光的熒光團是怎么煉成的。

一、熒光淬滅是什么?
先定義下熒光淬滅。熒光淬滅或者通俗點叫“褪色”,泛指降低熒光團熒光強度的所有過程。

①大致可以分為四種:
1、化合物形成complex formation

化合物形成淬滅
熒光物質分子與外部分子/離子反應形成非熒光化合物,常見的熒光淬滅就是高光強下氧化形成新的化合物,這種現象也叫光漂白photo bleaching,是不可逆的破壞。

2、能量轉移energy transfer

FRET:藍熒光轉移成黃熒光
顧名思義,能量出現了從供體到受體的轉移,如果受體不產生熒光,那熒光就熄滅了;如果受體產生熒光,就會出現受體熒光和次級熒光光譜紅移,這就是熒光共振能量轉移FRET.

3、激發態反應excited state reactions

ESIPT激發態分子內質子轉移②
激發態高能量下熒光團化學結構出現結構破壞,改變熒光特性,這種現象稱為激發態分子內質子轉移ESIPT,可以理解為2的質子轉移版本。

4、濃度淬滅collisional quenching

聚集誘導淬滅ACQ和聚集誘導熒光AIE③
熒光分子聚集或距離過近導致互相干擾,非輻射衰減概率增大,使發光效率下降,這種現象稱為聚集誘導淬滅ACQ。有些熒光團反過來,是在聚集態才會增強熒光,這種現象就是聚集誘導熒光發光AIE.

二、三種改造熒光團的嘗試④

熒光發光原理⑤
熒光團在激發態回到正常態需要釋放能量,要么發出熒光釋放,要么以震動等形式非輻射衰減釋放。理論上,減少非輻射衰減的比例,就能提升熒光釋放比例,以此獲得更高光強、更長的熒光壽命。

1、加固蛋白結構的mCherry

mCherry的結構渲染圖,外層螺旋是β-桶結構
通過改變熒光蛋白的蛋白支架結構,使其更穩定,從而提升熒光強度,延長熒光壽命,比如“加固”mCherry的β-桶結構,防止發色團的分子重排,可以減少非輻射衰減,得到的mCherry-XL 和 mScarlet3 都比mCherry更亮更耐光。


mScarlet3亮度是mCherry 5倍左右,壽命3倍以上

2、關閉非輻射衰減的EGFP

EGFP標記的斑馬魚,MZX81拍攝
通過模擬計算,科學家發現EGFP存在的一個非輻射途徑是電子從發色團轉移到酪氨酸殘基上,從而改變了熒光特性。把酪氨酸換成亮氨酸,可以阻斷這個非輻射途徑,成功將EGFP的耐光性提升80倍??上н@種EGFP的亮度受到了負面影響,變暗了,因此在生物領域可能用不上。

3、改良工藝的羅丹明系列染料

Janelia Fluor對比傳統染料
羅丹明是Texas Red、ROX、TAMRA等染料的基礎成分,傳統合成工藝在試劑環境、精度控制等方面存在局限,有科學家成功以更現代化的合成工藝對其進行改良,在烷基氨基取代基中引入氘原子,改變了關鍵分子尺寸,從而減少了非輻射衰減。這形成的就是Janelia Fluor系列熒光染料,覆蓋從綠色到紅色熒光光譜,可以提供幾倍于傳統熒光染料的熒光光強和熒光壽命。

三、如何更好地使用這些改良的熒光團?

mCherry-XL激發峰在Y波段
熒光團改良后,不僅熒光強度更高、熒光壽命更長,其激發發射屬性也可能發生變化。比如mCherry-XL和mScarlet3,它們需要使用Y通道激發,而不是原版mCherry的R通道激發。


MF43-N可升級Y激發塊支持mCherry-XL和mScarlet3
MF43-N和MF53-N可以通過安裝Y激發塊/G2激發塊支持mCherry-XL和mScarlet3,而其他顯微鏡可以選擇帶Y通道的數顯熒光模塊實現支持。


更亮更耐光的熒光團更適合dSTORM超分辨成像
但這些更亮更耐光的熒光團更大價值在于適用于更高要求的成像,比如共聚焦和超分辨熒光成像。使用MF53-TIRF升級成dSTORM成像時,需要搭配高亮度、高耐光的熒光染料,才能獲得更高信噪比的成像。而在一些神經學實驗中,已經有科學家利用這些新型染料,實現了對腦神經毫秒級的電信號變化進行熒光標記成像,從而更深入揭示神經元信息處理和學習的機制。

①Lakowicz, J.R. (1983). Quenching of Fluorescence. In: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer, Boston, MA. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-7658-7_9
②Pivovarenko, Vasyl. (2023). Multi-Parametric Sensing by Multi-Channel Molecular Fluorescent Probes Based on Excited State Intramolecular Proton Transfer and Charge Transfer Processes. BBA Advances. 3. 100094. 10.1016/j.bbadva.2023.100094. 
③Dongdong Li, Yuping Zhang, Zhiying Fan, Jie Chen and Jihong Yu, Coupling of chromophores with exactly opposite luminescence behaviours in mesostructured organosilicas for high-efficiency multicolour emission,DOI: 10.1039/C5SC02044A (Edge Article) Chem. Sci., 2015, 6, 6097-6101
④Ariana Remmel .TOWARDS BRIGHTER AND MORE PHOTOSTABLE FLUOROPHORES. Nature, 630, 258-260 (2024), doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-01591-7
⑤李迎春,分子發光分析熒光磷光,石河子大學藥學院.
⑥Pascal Poc ORCID logoa,et al,Interrogating surface versus intracellular transmembrane receptor populations using cell-impermeable SNAP-tag substrates, DOI: 10.1039/D0SC02794D (Edge Article) Chem. Sci., 2020, 11, 7871-7883

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